酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以簡單地回答樣本中有多少蛋白質(zhì)/多肽/抗體這一基本問題，是實驗室比較常用的一種檢測方法。而這種簡單的分析方法的核心，就是標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒有它，我們的實驗就變成了一個二元的“是/不是”測試。有了它，我們可以深入研究生物反應(yīng)的細(xì)節(jié)。那么，是什么使得標(biāo)準(zhǔn)曲線如此強大呢?讓我們在ELISA的背景來討論這個問題。
簡單地說，標(biāo)準(zhǔn)品就是一系列已知目標(biāo)蛋白數(shù)量的陽性對照。例如，如果對人類IgG進(jìn)行ELISA檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線將包含逐漸減少的已知量的人類IgG，它會讓你立刻得出一系列的結(jié)論。
1.我的ELISA實驗有效嗎?
是否可以看到標(biāo)準(zhǔn)品的信號？如果可以，實驗是好的；如果沒有，就應(yīng)該進(jìn)行故障排除。也許抗體問題，或者系統(tǒng)中的其他東西沒有得到優(yōu)化。
2.我的ELISA檢測正常嗎?
這是一個比較棘手的問題。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)濃度下降時，信號是否減少？如果答案是肯定的，那
就是一個好的開始。如果答案是否定的，可能在某些步驟引入了一些背景，或者移液管
可能需要校準(zhǔn)。
3.是否在系統(tǒng)中引入了背景?
一組適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品總是以空白結(jié)束，在空白孔中不存在標(biāo)準(zhǔn)品。如果空白孔OD值為>0.1，說明可能引入了一些背景。
計算未知數(shù)
標(biāo)準(zhǔn)曲線的真正能量在于它能夠測定未知樣品的濃度。如果我們觀察IgG反應(yīng)，我們可以將樣本的OD值與標(biāo)準(zhǔn)的OD值進(jìn)行比較，并根據(jù)相對OD值得出一些結(jié)論。例如，如果我們知道一個333 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品OD值在2.1左右，而一個111 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)OD值在1.7左右，那么我們可以假設(shè)一個未知的OD值在1.9左右應(yīng)該在200 ng/mL左右。直到我們把它畫在曲線上，然后得出一個方程。當(dāng)我們檢測到更多的目標(biāo)時，OD值上升，當(dāng)我們檢測到更少的目標(biāo)時，OD值下降。
那么，曲線一定是線性的嗎？這看起來不太對。坦白地說，這和我們的眼睛告訴我們的并不相符。如果我們有1200ng /mL的濃度，OD值會是3嗎?當(dāng)然不是。數(shù)據(jù)看起來接近一條水平漸近線——曲線不會通過這個值。所以不管濃度有多高，都不會超過2.5左右。類似地，這條曲線似乎表明，如果濃度為負(fù)，可以生成OD值在0.5左右。
4.參數(shù)對數(shù)曲線
使用圖1的數(shù)據(jù)來擬合，得到如下s曲線。這條曲線非常清楚地顯示了水平漸近線，同時也顯示了標(biāo)準(zhǔn)濃度增加或減少時的良好的、與劑量相關(guān)的響應(yīng)。
四參數(shù)方程的擬合函數(shù)表達(dá)式為：
在這個方程中，“a”和“d”分別表示可以得到的最小值和最大值——我們的漸近線。“c”表示拐點——曲線的中點，“b”表示曲線在“c”處的斜率。根據(jù)這個方程，我們現(xiàn)在可以反算出一個樣本的未知濃度。大多數(shù)ELISA閱讀器都可以自動完成這項工作。
它不僅限于競爭法, 夾心法也可以用它。它的形狀, 根據(jù)情況, 可能是一個單調(diào)上升的類似指數(shù), 對數(shù), 或雙曲線的曲線, 也可能是一個單調(diào)下降的上述曲線, 還可以是一條 S 形曲線。 它要求 X 值不能小于 0 (因為指數(shù)是實數(shù), 故有此要求)。 在很多情況下它都可以擬合 ELISA 的反應(yīng)曲線, 所以它也成了 ELISA 中應(yīng)用最廣的模型之一。
當(dāng)使用4參數(shù)擬合曲線時，記住一些實用的技巧是有幫助的。由于以漸近線開始和結(jié)束，曲線范圍之外的數(shù)據(jù)可能會產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果。更進(jìn)一步說，試著在S中間標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)工作。一般來說，未知計算在曲線的線性范圍內(nèi)更準(zhǔn)確。可以稀釋超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的樣本，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，然后根據(jù)初始稀釋值乘以相應(yīng)倍數(shù)。
