1、細胞凍存前12~24h，換新鮮培養基，使細胞一直處于對數生長期。
2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養基吹打后制成細胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。
3、棄上清，加入凍存液重懸細胞沉淀，調整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內，每管1~1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標記，標明細胞名稱、凍存日期等。（細胞凍存液配方可為胎牛血清：培養基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據各實驗室實際條件調整）
4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細胞凍存管放入程序降溫盒內可直接放入-80℃過夜，再轉至液氮罐內。注意程序降溫盒內異丙醇的量必須高于最低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次，以免影響凍存效果。
5、細胞凍存后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，為穩妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養，觀察細胞生長情況，再繼續凍存。
