用于RNAi的慢病毒包裝簡(jiǎn)要程序

以六孔板中的1孔為例，每個(gè)樣品需要1×10∧6個(gè)293FT細(xì)胞。
1、取1.5ml滅菌EP管，加入1.5μg包裝混合質(zhì)粒和0.5μg表達(dá)質(zhì)粒以及250μl的無血清Opti MEM。輕柔混勻，室溫孵育5min。
2、取1.5ml滅菌EP管，取9μl 脂質(zhì)體2000l溶于250μl無血清Opti-MEM I培養(yǎng)基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。
3、將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min
4、用胰酶消化并記數(shù)293FT細(xì)胞。用含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，再加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。
6、將1ml重懸的293FT細(xì)胞（1×10∧6個(gè)細(xì)胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育過夜。
7、移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除，代之以DMEM（含丙酮酸鈉和非必須氨基酸）。
7、轉(zhuǎn)染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C貯存。
包裝出來的慢病毒對(duì)NIH/3T3細(xì)胞達(dá)90%以上感染效率。